I- Spectrométrie de masse d’attachement anionique régiosélectif pour l’analyse de stéroïdes
La détection et l’analyse des stéroïdes est un axe de recherche important en chimie analytique à cause à la fois des problèmes de dopage sportif mais aussi de l’impact de ces composés sur la santé. Bien que la spectrométrie de masse soit une méthode de choix pour la détection de ces composés, beaucoup de progrès restent encore à faire notamment en termes de gain en sensibilité pour les stéroïdes à faible polarité. Nous avons récemment mis au point une nouvelle technique consistant en un attachement anionique régiosélectif pouvant permettre ce gain en sensibilité.
Le principe de cette méthode est simple : un petit anion ajouté à la solution contenant le stéroïde s’attache à celui-ci, produisant ainsi un ion négatif dont le signal est généralement plus grand que celui du stéroïde seul. Nos travaux ont montré que le site d’attachement de l’anion dépendait de la nature de celui-ci et qu’il était ainsi possible d’effectuer des attachements régiosélectifs d’anions. Nous développons actuellement des modèles permettant de mieux comprendre et de prévoir ces attachements d’anions. Ce travail est réalisé en partenariat avec l’Agence Française de Lutte contre le Dopage (AFLD).
II- Développement de nouvelles matrices MALDI-MS pour le mode négatif en vue de leurs exploitations pour l’analyse de l’ADN, des complexes non covalents, et des polyoxométallates
La réussite de la technique de désorption/ionisation assistée par matrice (MALDI) repose souvent sur la préparation de l’échantillon. Diverses études fondamentales ont tenté de proposer un modèle unifié des mécanismes de desorption/ionisation. Il en ressort l’importance de la matrice dans les étapes d’ablation et surtout au niveau de l’ionisation. Malgré ces efforts, on constate un manque de priorité pour perfectionner les matrices en mode négatif.
Ce projet dédié au développement méthodologique dans le but d’améliorer la réponse en mode négatif, se décompose en plusieurs étapes : la première étape consistera en l’exploration exhaustive de nouvelles préparations d’échantillon, par la découverte de nouvelles matrices. Ce projet tend notamment à rationaliser le choix de matrices (et/ou co-matrices) spécifiques pour le mode ion négatif en fonction de leurs propriétés physicochimiques. La seconde étape impliquera une meilleure compréhension des mécanismes de formation des ions par MALDI en mode ions négatifs, en rationalisant les développements précédents. Quelques facteurs expérimentaux cruciaux que l’on veut évaluer sont : la tendance de la surface à émettre des électrons, puis l’affinité protonique, et l’aspect cristallin de la matrice. Enfin, la troisième étape consistera à valoriser ces conclusions par la mise en applications à des échantillons habituellement difficiles à analyser tels que les biomolécules (par exemple, les fragments d’ADN), les organométalliques, les nanoclusters et les polyoxométallates. Une thèse dédiée à cette thématique démarre cette année.
III- Spectrométrie de masse à base d’un nanosystème pour agents biologiques d’ultra hautes masses
Ce projet provient de notre association à une ANR ASTRID rassemblant le LETI, le laboratoire EDyP et notre équipe. Cette association combine l’expertise en nano-systèmes, physique, biologie et développement instrumental de spectrométrie de masse. L’objectif à court terme du projet est de développer un spectromètre de masse NEMS qui permettra l’analyse de systèmes macromoléculaires trop grands pour être analysés par spectrométrie de masse conventionnelle. Les systèmes nano-électro-mécaniques (NEMS) sont extrêmement sensibles pour mesurer la masse inertielle individuelle des particules neutres ou ionisées qui s’adsorbent à leur surface. Cette méthode cible la détection de particules uniques, considérant le problème de section efficace de capture de bio-nanoparticules individuelles. L’objectif à long terme de cette recherche est de développer un appareil portable ayant la capacité de mesurer directement les masses de pathogènes posant une menace de bioterrorisme. En effet, Il est d’une importance cruciale de pouvoir détecter et identifier rapidement certaines toxines (tableau n°1 de l’organisation pour l’Interdiction des Armes Chimiques, Organization for the prohibition of Chemical Weapons (OPCM)).
Les systèmes NEMS de notre partenaire du LETI sont capables de détecter individuellement une particule de 1 GDa neutre ou faiblement ionisée avec un pouvoir de résolution de 105 à 106. Avec de telles valeurs, la technologie NEMS-MS se révèle être la seule technique capable de couvrir les besoins sur ce segment d’échelle [macroscopique – Infinitésimal] pour mesurer la masse des molécules de hautes masse dignes d’intérêt.
IV- Développement de nouvelles approches métabolomiques à haut débit par spectrométrie de masse à très haute résolution
Pour pouvoir répondre à des besoins concernant la veille sanitaire sur une grande échelle, il est nécessaire de disposer d’une méthodologie permettant de mettre en évidence l’état d’exposition réel de la population au risque chimique, notamment l’exposition combinée, à long terme et à faible dose, de plusieurs xénobiotiques. Il est intéressant dans cette perspective d’utiliser des approches métabolomiques qui consistent à mettre en évidence des perturbations du métabolisme général grâce aux modifications observées dans les empreintes analytiques. Cependant, une étude métabolomique implique l’analyse spectrale d’un grand nombre d’échantillons, conduisant à des temps d’analyses généralement longs.
Nous cherchons à développer une expertise en métabolomique (étude de biomarqueurs de faible masse moléculaire). Ces travaux de recherche se font depuis plusieurs années en collaboration avec l’INRA (Estelle Paris, Alain Paris) et le CEA (Christophe Junot). Nous poursuivons donc notre association, avec ce projet qui vise au développement et à la validation de nouvelles méthodologies utilisant la spectrométrie de masse à très haute résolution pour réaliser à haut débit des approches métabolomiques sur différentes matrices biologiques. Ces travaux seront réalisés sur nos instruments de spectrométrie de masse à très haute résolution tels que le FT-ICR-MS et le LTQ-Orbitrap. La spectrométrie de masse à très haute résolution est un outil très prometteur pour l’analyse directe de métabolites présents en mélange dans une matrice complexe sans avoir recours à une séparation chromatographique préalable, notamment dans les études métabolomiques à haut débit, ainsi que dans la caractérisation du xénométabolome et du « food » métabolome. La mise au point de la méthode sera réalisée à partir d’échantillons biologiques issus de cohortes disponibles à l’INRA ou au CEA et pour lesquels des analyses par LC/MS ou UPLC/MS qui auront déjà été réalisées, serviront de référence. Le projet vise également la création d’une base de données métabolomiques de référence à très haute résolution et des expériences MS/MS pour permettre la caractérisation à haut débit de biomarqueurs potentiels (deux thèses en cours dont une démarrée en 2011).
Figure 4 : Stratégie appliquée pour la métabolomique.
